JIP-test熒光參數(shù)PCA分析實(shí)操
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植物材料&處理方法(Material andmethods)
選用紫薇（Lagerstroemia indica Linn.）長(zhǎng)勢(shì)均勻、朝向一致的成熟葉，60℃熱水分別浸沒(méi)0s、10s、30s和60s熱脅迫處理。
快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP polyphasic chlorophyll Chl a fluorescence rise kinetics)
使用Handy PEA(Hansatech Instruments Ltd., Norfolk, UK)測(cè)定，時(shí)長(zhǎng)2s，光強(qiáng)3000 μmol·m–2·s–1。測(cè)定前所有樣品由暗適應(yīng)夾遮光處理30min。依據(jù)JIP-test能量流動(dòng)模型理論(Strasser et al. 2004)熒光參數(shù)由PEA Plus軟件直接計(jì)算并導(dǎo)出。
根據(jù)Springer Nature 2018出版的《Advances in Plant Ecophysiology Techniques》歸類總結(jié)的熱脅迫對(duì)快速Chl熒光(OJIP)參數(shù)的影響(點(diǎn)擊這里閱讀此文)選擇相應(yīng)敏感參數(shù)進(jìn)行PCA分析，所選JIP-test熒光參數(shù)介紹詳見(jiàn)文末附表1。
數(shù)據(jù)分析軟件(Statistical analysis)
數(shù)據(jù)PCA分析處理及作圖分別使用IBM SPSS Statistics 26(IBM Corp)和Excel 2016(Microsoft Corp)。
操作步驟(Operation Steps)
一、 原始數(shù)據(jù)的導(dǎo)出&預(yù)處理
樣品測(cè)定結(jié)束后，通過(guò)PEA Plus軟件對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行分組預(yù)處理、導(dǎo)出并標(biāo)準(zhǔn)化處理OJIP曲線和導(dǎo)出JIP-test熒光參數(shù)，詳細(xì)操作方法點(diǎn)擊這里查看視頻教程。
二、PCA主成分分析操作步驟
1. 將JIP-test熒光數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS軟件后，如上圖點(diǎn)擊工具欄“分析”→“降維”→“因子”，彈出PCA分析設(shè)置對(duì)話框。
2. 如下圖，將選定的需要進(jìn)行PCA分析的JIP-test熒光參數(shù)導(dǎo)入至“變量”欄中。
3. 點(diǎn)擊“描述”，選中“KMO和巴特利特球形度檢驗(yàn)”：使用主成分分析進(jìn)行信息濃縮研究，首先應(yīng)分析研究數(shù)據(jù)是否適合進(jìn)行主成分分析。
(i)分析KMO值：如果此值高于0.8，則說(shuō)明所選數(shù)據(jù)非常適合進(jìn)行PCA分析；如果此值介于0.7~0.8之間，則說(shuō)明比較適合進(jìn)行PCA分析；如果此值介于0.6~0.7，則說(shuō)明可以進(jìn)行PCA分析；如果此值小于0.6，說(shuō)明不適合進(jìn)行PCA分析；
(ii)如果Bartlett檢驗(yàn)對(duì)應(yīng)p值小于0.05也說(shuō)明適合進(jìn)行主成分分析。
4. 點(diǎn)擊“提取”，選擇顯示“碎石圖”，提取“因子的固定數(shù)目”為2。
碎石圖用于輔助判斷主成分提取個(gè)數(shù)，當(dāng)折線由陡峭突然變得平穩(wěn)時(shí)，陡峭到平穩(wěn)對(duì)應(yīng)的主成分個(gè)數(shù)即為參考提取主成分個(gè)數(shù)。
碎石圖僅輔助決策主成分個(gè)數(shù)，實(shí)際研究中更多以專業(yè)知識(shí)，結(jié)合主成分與研究項(xiàng)對(duì)應(yīng)關(guān)系情況，綜合權(quán)衡判斷得出主成分個(gè)數(shù)，此處我們選擇提取的主成分個(gè)數(shù)即“因子的固定數(shù)目”為2。
5. 點(diǎn)擊“旋轉(zhuǎn)”，選擇旋轉(zhuǎn)方法為“最大方差法”，并選擇顯示“載荷圖”。
使用最大方差法使得降維后同一緯度的方差最大且不同維度之間的相關(guān)性為0，而載荷圖用于展示各成分與載荷值關(guān)系情況或各成分再不同維度上的分布情況。
6. 點(diǎn)擊“得分”，選擇因子得分"保存為變量"，并“顯示因子得分系數(shù)矩陣”
通過(guò)因子得分系數(shù)，分析出各JIP-test熒光參數(shù)與各主成分因子(PC1&PC2)的對(duì)應(yīng)關(guān)系或相關(guān)性情況。7. 點(diǎn)擊“選項(xiàng)”，選擇系數(shù)顯示格式“禁止顯示小系數(shù)”且絕對(duì)值為0。設(shè)置絕對(duì)值為0可顯示全部因子得分系數(shù)，可用于后續(xù)聚類分析處理。8. 點(diǎn)擊“確定”即可得出PCA分析結(jié)果。
三、PCA主成分分析結(jié)果查驗(yàn)
1. 彈出PCA分析結(jié)果查看器后，首先如下圖查看“KMO值”(＞0.6)和“巴特利特球形度檢驗(yàn)顯著性p值”(＜0.05)是否符合PCA分析要求。
2. 查看PCA提取因子PC1&PC2對(duì)所有參數(shù)的提取分離度，如下圖PC1和PC2對(duì)所有參與分析參數(shù)的累積分離度分別為59.643%和32.042%，PC1&PC2共同的累積分離度為91.685%，表明經(jīng)PCA處理分析得到的兩個(gè)成分因子可對(duì)所選參數(shù)有極佳的分離描述度。同時(shí)通過(guò)“碎石圖”可更直觀的查看各成分因子(PC1、PC2...)對(duì)參數(shù)的累計(jì)分離度。
3. 初步預(yù)覽所選JIP-test參數(shù)“旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣”以及在由PC1&PC2組成的二維平面上的分布情況。該成分矩陣表用于后期參數(shù)分布圖的制圖。
4. 返回“數(shù)據(jù)編輯器”預(yù)覽經(jīng)PCA分析后新生成保存的各樣品“主成分因子得分表"，表明各樣品在PC1&PC2的得分情況，該得分表用于后續(xù)所有測(cè)定樣品的聚類分析。
四、PCA主成分分析結(jié)果的可視化操作
n 聚類分析——樣品和JIP-test參數(shù)主成分聚類分析的可視化
將所有樣品“主成分因子得分表”和JIP-test參數(shù)“旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣”復(fù)制至新建Excel表中。
1. 選中同一處理組樣品的PC1&PC2得分，點(diǎn)擊”插入“→”散點(diǎn)圖“。
2. 在新生成散點(diǎn)圖處，點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵→點(diǎn)擊”選擇數(shù)據(jù)“→分別設(shè)置各處理組系列名稱及X軸、Y軸對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)，詳細(xì)操作見(jiàn)下方視頻。
3. JIP-test參數(shù)在主成分坐標(biāo)系中的分布同樣品聚類分析操作類似，選中所有參數(shù)PC1&PC2得分插入散點(diǎn)圖即可。
詳細(xì)操作步驟請(qǐng)查看本試驗(yàn)下方教程視頻：
n 參數(shù)分布變化——單一處理組JIP-test參數(shù)主成分分布可視化
除將所有處理組共同聚類分析外，如下圖還可將不同處理組JIP-test參數(shù)分布變化進(jìn)行對(duì)比。
1. 在SPSS軟件中將不同處理組樣品參數(shù)分別進(jìn)行PCA主成分分析。
2. 獲得單一處理組PCA分析結(jié)果后，將該組JIP-test參數(shù)“旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣”復(fù)制到Excel中。
3. 為獲得每一參數(shù)點(diǎn)箭頭指示連接符，需將各JIP-test參數(shù)在坐標(biāo)系中的位點(diǎn)轉(zhuǎn)換為向量值。
4. 在每一參數(shù)上部添加一空白行，并輸入原點(diǎn)"0"。
5. 選中單一參數(shù)數(shù)據(jù)，插入散點(diǎn)圖，分別設(shè)置X軸&Y軸坐標(biāo)為連接原點(diǎn)的向量值。以新系列形式逐一添加所有參數(shù)至散點(diǎn)圖中。
6. 設(shè)置箭頭顏色、樣式，隱藏?cái)?shù)據(jù)點(diǎn)，添加系列標(biāo)簽，標(biāo)記分簇即可。
單一處理組JIP-test參數(shù)主成分分布可視化詳細(xì)操作教程見(jiàn)下方視頻：
結(jié)果分析(Result)
通過(guò)PCA技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，所選的JIP-test參數(shù)形成了三個(gè)較好分離的簇。其中兩個(gè)位于PC1(Cluster 1&3)上，一個(gè)位于PC2(Cluster 2)上。每一組參數(shù)描述了不同的生理過(guò)程：光能捕獲和傳遞階段(Cluster 1)、電子傳遞鏈末端性能(Cluster 2)和耗散階段(Cluster 3)。PC1對(duì)應(yīng)PSII活性，較高的值表示更高的PSⅡ性能(低光吸收、高光化學(xué)和電子傳輸效率)，代表參數(shù)包括Fv/Fm、PIABS、ABS/RC、DIo/CSm等；PC2則對(duì)應(yīng)PSⅠ活性，較高的值表明PSⅠ性能較高，代表參數(shù)包括φRo、δRo、REo/RC等。
對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)照和處理進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照集中在Cluster1附近，隨著脅迫程度的加深，聚類的位置也在發(fā)生改變：10s處理位于Cluster1和Cluster2之間，30s處理位于Cluster2和Cluster3之間，60s處理位于Cluster3附近。
結(jié)合參數(shù)分析，對(duì)照表現(xiàn)出較高的PS2性能，10s處理的PS2性能出現(xiàn)受損，30s處理則表現(xiàn)出較低的PS2性能和較高的PSⅠ性能，60s處理的PSⅠ和PSⅡ性能表現(xiàn)最差。
以上分析說(shuō)明，高溫處理較短時(shí)間會(huì)損傷PSⅡ的性能，但是PSⅠ的性能會(huì)相對(duì)提高；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，PSⅠ和PSⅡ性能都會(huì)被破壞。
如下兩圖為對(duì)照組和高溫處理后，被測(cè)參數(shù)主成分分布關(guān)系的變化。對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，Fv/Fm、PIABS、ETo/CSm等光系統(tǒng)PSⅡ性能相關(guān)參數(shù)聚集在PC2上；φRo、δRo、REo/CSm等光系統(tǒng)PSI相關(guān)參數(shù)則在PC1上；ABS/RC、Mo、Wk三個(gè)參數(shù)成簇，位于PC1上；DIo/CSm近乎在原點(diǎn)。
60s高溫處理后，PSⅡ相關(guān)參數(shù)轉(zhuǎn)移到PC1上，PSⅠ相關(guān)參數(shù)轉(zhuǎn)移到PC2上，ABS/RC、Mo與DIo/CSm聚集成簇，Wk轉(zhuǎn)移到PC2上。
以上變化表明，高溫處理主要影響PSⅡ的性能，ABS/RC、Mo與DIo/CSm則減弱高溫處理的影響，ABS/RC代表光捕獲，Mo代表能量傳遞，DIo/CSm代表耗散，這三個(gè)參數(shù)越大，代表樣品的耐熱性越強(qiáng)。
另附上熱處理紫薇OKJIP曲線，詳細(xì)制圖方法本文不再詳細(xì)介紹，可點(diǎn)擊下面鏈接查看詳細(xì)視頻教程。
[研究方法]|PEA植物效率分析儀數(shù)據(jù)處理方法（視頻）
附表1. 熱脅迫JIP-test熒光參數(shù)PCA分析所選參數(shù)
由OJIP曲線直接獲得參數(shù)導(dǎo)出的參數(shù) | |
M0 = (ΔV/Δt)0 = 4(F300μs−F0)/(FM−F0) = TR0/RC−ET0/RC | 瞬態(tài)熒光V=f(t)的近似初始斜率（每毫秒）。該參數(shù)反映了PSⅡ活性反應(yīng)中心（RCs）的關(guān)閉速率。 |
Sm = (AM)/(FM−FO) | 標(biāo)準(zhǔn)化的OJIP曲線上部與坐標(biāo)軸圍成的面積。該參數(shù)反映了QA的多次更替還原或關(guān)閉所有開(kāi)放的PSⅡ活性反應(yīng)中心（RCs）所需的激發(fā)能。 |
N = (SM/SS) = SMM0(1/VJ) | 從0點(diǎn)至P點(diǎn)時(shí)間內(nèi)，QA被還原的次數(shù)/周轉(zhuǎn)數(shù) |
單位PSⅡ活性反應(yīng)中心（RC）能量比通量（QA還原態(tài)時(shí)） | |
ABS/RC = M0(1/VJ)(1/ϕPo) | 單位PSⅡ活性反應(yīng)中心吸收的能量通量 |
DI0/RC = (ABS/RC)−(TR0/RC) | t=0時(shí)，單位PSⅡ活性反應(yīng)中心熱耗散的能量通量 |
RE0/RC = (1−VI)×(M0/VJ) | t=0時(shí)，單位PSⅡ活性反應(yīng)中心還原PSⅠ末端電子受體的比電子通量 |
單位葉截面積表觀量子通量 | |
ABS/CSm ≈ FM | 達(dá)到熒光最大值（t=tFm）時(shí)，單位葉截面積吸收的能量，近似等于FM |
TR0/CSm = ϕPo(ABS/CSm) | 達(dá)到熒光最大值（t=tFm）時(shí)，單位葉截面積捕獲的能量 |
ET0/CSm = ϕЕo(ABS/CSm) | 達(dá)到熒光最大值（t=tFm）時(shí)，單位葉截面積電子傳遞的能量 |
DI0/CSm=(ABS/CSm) – (TR0/CSm) | 達(dá)到熒光最大值（t=tFm）時(shí)，單位葉截面積熱耗散的能量 |
RE0/CSm | 達(dá)到熒光最大值（t=tFm）時(shí)，單位葉截面積還原PSⅠ末端電子受體的比電子通量 |
量子產(chǎn)率或能量通量比 | |
FV/FM = ϕPo ≡ TR0/ABS = [1 – (F0/Fm)] | t=0時(shí)，原初光化學(xué)反應(yīng)的最大量子產(chǎn)額，指PSII反應(yīng)中心捕獲吸收的光子（或激子在天線上遷移）能量的比率 |
FV/F0 = ϕPo/(1 – ϕPo) | 原初光化學(xué)反應(yīng)（電子傳遞至QA-）效率 |
F0/FM = ϕDo ≡ 1 – ϕPo | t=0時(shí)，能量耗散的量子效率 |
ϕEo = ET0/ABS = [1 – (FO/FM)] ψ0 = ϕPoψ0 | t=0時(shí)，電子從QA-轉(zhuǎn)移到電子傳遞鏈的量子效率 |
ψ0 ≡ ET0/TR0 = (1 − VJ) | t=0時(shí)，PSⅡ活性反應(yīng)中心捕獲的激子驅(qū)動(dòng)電子傳遞的比率 |
δRo= RE0/ET0 = (1 – VI)/(1 – VJ) | 還原PSⅠ受體測(cè)末端電子受體的電子占電子傳遞鏈電子的比率 |
ϕRo = ϕPo ϕEo δRo = RE0/ABS = ϕPo(1 – VI) | 還原PSⅠ受體測(cè)末端電子受體的量子產(chǎn)率 |
性能指數(shù) | |
PIabs | 基于吸收的性能指數(shù)：表述了從光子的吸收至電子傳遞鏈的還原的性能指數(shù) |
PItotal | 總性能指數(shù)：表述了從光子吸收至PSI末端電子受體的還原的性能指數(shù) |
驅(qū)動(dòng)力 | |
DFabs | 基于吸收的驅(qū)動(dòng)力：表述了從光子的吸收至電子傳遞鏈的還原的驅(qū)動(dòng)力 |
DFtotal | 總驅(qū)動(dòng)力：表述了從光子吸收至PSI末端電子受體的還原的驅(qū)動(dòng)力 |
特征值 | |
Wk = (Fk – F0 )/(Fj – F0 ) | K點(diǎn)的相對(duì)可變熒光，可指示PSII供體側(cè)的放氧復(fù)合體(OEC)的損傷程度 |
RC/CSm = ϕPo(VJ /M0 )(ABS/CSm) | 達(dá)到熒光最大值（t=tFm）時(shí)，單位葉截面積活性反應(yīng)中心的數(shù)量 |
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